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酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒!
點(diǎn)擊次數(shù):1108 更新時(shí)間:2016-04-20

   酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒!

    酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

    原理:ELISA可用于測定抗體,也可用于檢測杭原。其基本原理是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接,然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng),用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體(免疫吸附劑);②酶標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物);③酶作用的底物(顯色劑)。

    ELISA過程包括:抗原吸附在固相載體上,這個(gè)過程稱為包被,加待測抗體,再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體,生成抗原--待測抗體--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物,再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體的量。

    根據(jù)檢測目的和操作步驟不同,有以下三種類型的常用方法:

    3.1間接法此法是測定抗體zui常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體。加人待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后,加人酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測定。

    3.2雙抗體夾心法此法常用于測定抗原。將已知抗體吸附于固相載體,加人待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌,加人酶標(biāo)板中。

    3.3競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定,也可用于測定抗體。以測定抗原為例,將特異性抗體吸附于固相載體。加入待測抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原,使二者竟?fàn)幣c固相抗體結(jié)合;經(jīng)過洗滌分離,zui后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。

    一、酶聯(lián)免疫吸附法測定抗體含量(競爭法)

    1、儀器設(shè)備

    酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-550);酶標(biāo)板(96孔);微量注射器。

    2、試劑

    (1)HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1:1000,國產(chǎn));標(biāo)準(zhǔn)牛IgG;兔抗牛血清(1:256);

    (2)包被液:0.05mol/LpH9.6碳酸緩沖液,4℃,保存, Na2CO30.15g,NaHCO30.293g,蒸餾水稀釋至100mL。

    (3)稀釋液與洗滌液:0.01mol/LpH7.4PBS--Tween--20,4℃,保存。NaCl8g,KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,Tween—20,0.5mL。蒸餾水加至1000mL。

    (4)封閉液:含0.1%明膠0.01mol/LPBS,pH7.4。

    (5)鄰苯二胺底物溶液(臨用前配制):臨用前將Na2HPO4·12H2O2.9g,檸檬酸0.51g溶于100mL蒸餾水中,再加入40mgOPD,40μL30%H2O2。

    (6)終止液:2mol/LH2SO4。于500mL蒸餾水中加入98%濃硫酸76mL混均即可。

    3、操作方法

    (1)將抗原結(jié)合在酶標(biāo)板上。取標(biāo)準(zhǔn)IgG(10mg/mL)用碳酸鹽緩沖溶液稀釋,得到濃度為0.1μg/mL的包被液,每孔加人100μL抗原包被液,并以不加標(biāo)準(zhǔn)抗原的兩孔為對照,為反應(yīng)的0%值,將反應(yīng)板于4℃放置一夜(8個(gè)樣品,分3個(gè)平行,4個(gè)100%值孔;共28+2孔)。

    (2)標(biāo)準(zhǔn)牛IgG與初級抗體一兔抗牛血清的反應(yīng)。將標(biāo)準(zhǔn)IgG(10mg/mL)用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG(4μg/mL至0.325μg/mL)各200μL,加到入32倍稀釋好的200μL的兔抗牛血清中,其中4個(gè)不加標(biāo)準(zhǔn)牛IgG作為測量時(shí)的100%值。4℃反應(yīng)放置一夜。

    (3)封閉板。將包被好的酶標(biāo)板孔內(nèi)液體傾去,進(jìn)行洗滌,各孔加200μL洗滌液后室溫下放置1min,倒掉,如此重復(fù)4次后,在吸水紙上拍干,加封閉液進(jìn)行封閉,在37℃放置45min(注意:空白孔也要加封閉液)。封閉后,如前述洗滌。

    (4)向酶標(biāo)板中加人標(biāo)準(zhǔn)抗原和抗體的混合物。將標(biāo)準(zhǔn)牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶標(biāo)板孔內(nèi),同是4個(gè)未加抗原的100%值的平行樣也加入酶標(biāo)板中。37℃放置2h,再洗板4次。

    (5)加人HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。洗滌后每孔加100μL稀釋好的HRP-羊抗兔IgG,37℃放置1h,洗滌。

    (6)加人OPD底物。洗板4次后,每孔加人100μL底物溶液,于37℃暗處反應(yīng)20min后,每孔加人50μL結(jié)束反應(yīng)液以終止反應(yīng)。

    (7)吸收測定。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長為492nm下的吸光值。

    (8)數(shù)據(jù)處理。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以Ig(標(biāo)準(zhǔn)牛IgG含量)對B/Bo作圖,求得線性方程。其中,C為標(biāo)準(zhǔn)牛IgG含量;B為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)牛IgG吸收值與0%吸收值之差;Bo為100吸收值與0%吸收值之差。

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