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人ELISA試劑盒的兩種操作方法
點(diǎn)擊次數(shù):1432 更新時(shí)間:2016-08-23

   人ELISA試劑盒又稱ELISA檢測(cè)試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒等,自動(dòng)上世紀(jì)660年代問世以來,迅速得到了*科研工作者的認(rèn)同,并得到了廣泛地應(yīng)用,尤其是在生化領(lǐng)域中以及免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中,具有穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單、容易保存等優(yōu)勢(shì)。

  一般來說,人ELISA試劑盒可以采用兩種不同的方法進(jìn)行操作,分別是:雙抗體夾心法以及間接法,其中:

  一、雙抗體夾心法

  1、包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃ 過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌,下同)

  2、加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。

  3、加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時(shí),洗滌。

  4、加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。

  5、終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

  6、結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽性。

  二、間接法

  1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜;

  2、次日洗滌3次;

  3、加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌;

  4、(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照)于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml;

  5、37℃孵育35-60分鐘,洗滌;

  6、zui后一遍用DDW洗滌。

  其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

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