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瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理與注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù):179 更新時(shí)間:2024-06-14

  瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA原理
  
  瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑒定DNA片段的典型方法,其特點(diǎn)為簡(jiǎn)便、快速。
  
  DNA片段瓊脂糖凝膠電泳的原理與蛋白質(zhì)的電泳原理基本相同,DNA分子在高于其等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA分子在電場(chǎng)中通過(guò)介質(zhì)而泳動(dòng),除電荷效應(yīng)外,凝膠介質(zhì)還有分子篩效應(yīng),與分子大小及構(gòu)想有關(guān)。
  
  對(duì)于線形DNA分子,其電場(chǎng)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。核酸分子是兩性解離分子,pH3.5是堿基上的氨基解離,而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離,所以分子帶正電,在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng);而pH8.0-8.3時(shí),堿基幾乎不解離,而磷酸基團(tuán)解離,所以核酸分子帶負(fù)電,在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。
  
  瓊脂糖凝膠電泳的適用范圍
  
  瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖,具親水性,但不帶電荷,是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下(pH8.0的緩沖液)帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng),不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同,在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率液不同。溴化乙錠(EB)可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物,經(jīng)紫外線照射后,可分出不同的區(qū)帶,達(dá)到分離、鑒定分子量,篩選重組子的目的。
  
  (按0.3-1.5%的瓊脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝膠,20-100kb的DNA用0.5%的凝膠,200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠)
  
  瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)需注意以下幾點(diǎn):
  

  1.體系配制時(shí)候最關(guān)鍵的幾個(gè)試劑一定要確定它們還有效、或者還沒(méi)被污染:引物,酶,超純水。這些東西最好自己收好,寫上個(gè)人的名字放好,冰盒上記得帶上橡皮筋,這樣就不會(huì)因?yàn)閯e人翻冰箱時(shí)候把你的冰盒碰散了,試劑都碰掉。否則,你的試劑被污染了,到時(shí)候陰性對(duì)照狂出條帶,再去找污染源很麻煩。而且配置體系時(shí)候要注意保持實(shí)驗(yàn)區(qū)的干凈,事先可用小噴壺進(jìn)行酒精噴霧,固定空氣中的DNA,而且全程要戴手套,避免污染體系。
  
  2.pcr體系要摸準(zhǔn),最好用人家都做得很多的老體系來(lái)上手。
  
  3.要想得到漂亮的電泳圖,可以在PCR開始時(shí)候就把膠倒上(前提是你的PCR總時(shí)間在1.5小時(shí)左右,并且1.5小時(shí)候之后你還在實(shí)驗(yàn)室。),讓凝膠涼著,這樣凝膠的上樣孔會(huì)比較規(guī)則,膠體里面的其本身的孔徑也會(huì)較規(guī)則。如果你要第二天再跑膠,千萬(wàn)記得把PCR完畢的樣本放入4℃保存。第二天做時(shí)候建議把膠涼上25分鐘左右。
  
  4.瓊脂糖凝膠電泳上樣時(shí)候建議使用排槍上樣,不僅快速而且樣本加到膠孔里的速度一致。當(dāng)然,排槍上樣最好選用進(jìn)口Qiang頭。
  
  5.不管電泳室使用的頻率高還是低,我都建議每次瓊脂糖凝膠電泳時(shí)候更換電泳液,避免出現(xiàn)“^"形條帶。

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