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Trizol法提取RNA原理以及詳細(xì)步驟
點(diǎn)擊次數(shù):279 更新時(shí)間:2024-06-27

Trizol試劑的主要成分是苯ben酚。苯ben酚的主要作用是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解,從而使細(xì)胞當(dāng)中的蛋白質(zhì)以及核酸物質(zhì)解聚而得以釋放。ben酚雖然可以有效的使蛋白質(zhì)變性,但它不能wan全抑制RNA酶的活性,因此Trizol中還加入了8-羥基喹/啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase(即RNA酶)。

Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。在樣品的裂解液或勻漿中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯/仿(CHCl3)后離心,樣品能分成水樣層和有機(jī)層。而RNA存在于水樣層中。在收集上面的水樣層后,RNA可以通過(guò)異丙醇沉淀的方法來(lái)還原。在除去水樣層之后,樣品中的核酸和蛋白也能相繼以沉淀的形式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA,在有機(jī)層中加入異丙醇能析出有機(jī)層的蛋白。

Trizol試劑不但可用于小量樣品(組織:50-100mg;細(xì)胞:5×106),也可用于大量樣品(組織≥1g或細(xì)胞≥107),對(duì)動(dòng)物、植物、細(xì)菌、血液提取都適用,可同時(shí)處理大量不同樣品。反應(yīng)迅速,提取的總RNA沒(méi)有DNA和蛋白質(zhì)污染,可用于Northernblot、RT-PCR、RNase保護(hù)分析等。


Trizol法提取RNA原理以及詳細(xì)步驟


TRIZOL提取RNA步驟

1、在提取組織RNA時(shí),每50~100mg組織用1ml Trizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解;提取細(xì)胞RNA時(shí),先離心沉淀細(xì)胞,每5-10╳106個(gè)細(xì)胞加1ml Trizol后,反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞。

2、將組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘;在EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿,蓋上EP管蓋子,在手中用力震蕩15秒,在室溫下(15℃~30℃)放置2~3分鐘后,12000g(2℃~8℃)離心15分鐘。

3、取上層水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇,在室溫下(15℃~30℃)放置10分鐘,12000g(2℃~8℃)離心10分鐘。

4、按照每1mlTRIZOL加1ml 75%乙醇進(jìn)行洗滌,渦旋混合,7500g(2℃~8℃)離心5分鐘,棄上清;讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥;用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。

Ps:在收集到生物材料之后,最好馬上進(jìn)行RNA制備工作。若需暫時(shí)儲(chǔ)存,則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后,儲(chǔ)存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時(shí),將儲(chǔ)存于冷凍柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞,不可以先行解凍,以避免RNase的作用。

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